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　　[36]耿松梅,李蓝,王倩倩,等.整合素β1在皮肤鳞状细胞癌组织中的表达作用[J].中国医学科学院学报, 2010, 32（1）：60-64.

　　[42]田鲲,陈宇,耿宁,等.基质金属蛋白酶及其组织表达失衡与涎腺恶性肿瘤浸润生长的关系[J].华西口腔医学杂志, 2005, 23（4）：273-279.

　　【摘要】肿瘤干细胞是在肿瘤中具有自我更新能力并能够产生特异性肿瘤细胞的细胞。近年来,越来越多的学者认为肿瘤干细胞的是恶性肿瘤复发和转移的根源。随着研究的深入,肿瘤干细胞的靶向治疗为恶性肿瘤的治疗带来了新的希望。本文对近年来肿瘤干细胞的研究现状作以综述。

　　恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病,虽然现在肿瘤的诊断和治疗水平已有了极大的提高,但肿瘤的复发和转移仍是导致肿瘤治疗失败及病人死亡的一个重要原因。因此,如何尽早地发现恶性肿瘤并预防其转移已经逐渐成为医学领域的一大热点。许多研究表明肿瘤细胞在增值和分化等方面与干细胞有着极为相似的地方,在几乎所有的肿瘤中都潜伏者极少量的肿瘤干细胞,而这些肿瘤干细胞很可能是导致肿瘤复发和转移的根源,因此研究肿瘤干细胞对未来肿瘤的诊断、治疗将产生深远的影响。

　　肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是在肿瘤中具有自我更新能力并能够产生特异性肿瘤细胞的细胞。40年前,Hamburger等[1]对来自肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤的肿瘤细胞进行体外培养,发现仅有1/5 000~1/1 000的肿瘤细胞能形成克隆,这表明不是全部的肿瘤细胞可以形成肿瘤,而是仅有极少数肿瘤细胞才具有致瘤性。Dick等首次从人急性髓样白血病中分离出白血病肿瘤干细胞,从而证实了肿瘤干细胞的存在。随后研究者们相继在乳腺癌、脑肿瘤及其他系统的肿瘤中找到了相似的肿瘤干细胞,为肿瘤干细胞学说添加了充分的证据。

　　白血病是目前公认的由肿瘤干细胞引起的造血系统疾病,也是目前研究比较深入的一类疾病。park等人发现在白血病大鼠中提取的白血病细胞中仅有不到1%的细胞能在体外形成克隆,而且在体内形成克隆的也不过4%,这说明有少数白血病细胞能在体内外增生。Blair等人对急性髓性白血病的研究表明,不同的白血病细胞亚群移植到严重联合免疫缺陷病的裸鼠,其肿瘤细胞成瘤能力差异巨大,大部分的白血病细胞不能有效增殖,仅少数细胞有稳定持续的形成肿瘤克隆的能力。这些细胞的表面标志为[Thy-1-, CD34+, CD38-],约占白血病细胞总数的0.2%-1%,而造血干细胞为[Thy-1+, CD34+, CD38-],两者非常相似。所以,白血病干细胞可能来源于Thy-1-的祖细胞,或者是丧失了Thy-1+表达能力的干细胞[2]。

　　2003年Singh等[3]从多种脑肿瘤中分离出肿瘤源性细胞。这些细胞具有神经干细胞分子标志CD133和巢蛋白,在体外培养可分化形成细胞表型与原位肿瘤类型相同的肿瘤细胞。2004年Galli等[4]将这类细胞注射入小鼠颅内,在内产生了与原肿瘤类似的肿瘤,从体内研究进一步证实了脑肿瘤干细胞的存在。

　　2003年,AI-Hajj等[5]从人的乳腺组织中分离出预期的乳腺癌起始细胞(Breast Cancer-Inition Cell, BrCa-IC)。他们从乳腺癌的组织或胸水转移癌细胞中,根据细胞表面特异性的标志分离纯化出乳腺癌干细胞。这种细胞以in-ESA+CD44+CD24-/low为特异性细胞表面标志,虽然只占小鼠移植乳腺癌的2%,但其致瘤能力比未分类细胞大50倍,即只需200个此种细胞便可在小鼠乳腺中形成肿瘤。AI-Hajj等在接下来的实验中用Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞免疫小鼠,发现新形成的肿瘤与原来肿瘤的表型异质性相似,而且也仅Lin-ESA+CD44+CD24-/low细胞具有致瘤源性;与之相对的是,即使移植数千个其他表型的癌细胞,也不能形成移植肿瘤灶,这便充分证明了在NOD/SCID小鼠所形成的肿瘤灶内既包括这群肿瘤源性细胞,又包括其他表型的肿瘤细胞。

　　胰腺癌细胞表面分子CD44、CD24和ESA的表达也存在异质性。Li等[6]研究发现,从患者原发性肿瘤中分离出的胰腺癌细胞通过三种表面标志分子CD44、CD24及ESA进行分选后,接种至NOD/SCID小鼠中观察其成瘤性。结果显示,未经过流式分选的细胞在102~104个细胞范围内,接种后连续观察16周均无明显的肿瘤形成。而经过CD44、CD24和ESA分选后的细胞致瘤性明显增强,其中CD44+CD24+ESA+的胰腺癌细胞虽然所占的比例很少(占0.2%~0.8%),但致瘤性最强,只需100个即可在NOD/SCID小鼠中形成肿瘤,并且在小鼠体内连续传代的肿瘤中,这群细胞的比例不发生改变。不仅如此,CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞作为胰腺癌干细胞的这一特征在组织学中也得到证实。CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞形成的移植瘤与患者的原发性肿瘤相比不仅病理表现十分类似,而且胰腺癌分子标志物的表达类型也非常相近。这些均说明CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞具有自我更新和多向分化等干细胞特征。

　　此外,在肺癌、肝癌及前列腺癌中也已进行了肿瘤干细胞的研究,更进一步证实肿瘤干细胞是肿瘤发生的根源。

　　肿瘤干细胞的发现为肿瘤的生长和转移提供了一种新的理论解释,也为肿瘤治疗开辟了一条新的思路。虽然目前针对肿瘤干细胞的研究取得了一些进展,有若干的证据证明了肿瘤干细胞的存在及意义,但肿瘤干细胞领域中还有许多问题有待探索。例如正常细胞是如何转变为肿瘤干细胞的;各种组织的肿瘤干细胞是否来源于同一种源细胞等等。虽然肿瘤干细胞的研究刚刚起步,但是肿瘤干细胞理论确实为肿瘤疾病的攻克及预防提供了可能和希望,相信随着肿瘤干细胞研究的进一步深入,必将引发新一轮临床肿瘤治式及肿瘤靶向用药研发的变革,人类战胜肿瘤疾病的时刻在不远的将来定会实现。

　　目前肝移植是各类终末期肝病的主要治疗方法。但由于供肝的严重缺乏，大大限制了其广泛应用，很多患者因得不到供肝而死亡。肝细胞移植在等待肝移植的过程中起到桥梁作用，为实现肝移植带来希望。但由于可用于移植的肝细胞数量不足，加之移植后次数少等原因使其纠正肝功能的作用有限，而干细胞的出现恰恰解决了这一难题。干细胞是一类能自我复制增殖并具有分化为多种类型细胞潜能的细胞群，能根据需要通过控制条件使其分化为需要的、代替受损的或病态的细胞，较肝细胞有更小的免疫排斥反应，可更好地达到恢复器官功能、治愈疾病的目的。对肝干细胞的研究已进入临床前期和临床试验阶段，具有重大临床意义和应用前景。

　　1.1胎肝细胞胎肝细胞是胚胎时期形成肝脏的前体细胞，较成熟肝细胞具有更大的增殖潜能。Dabeva等［1］对14 d大鼠胎肝的细胞类型分析发现了一类细胞同时表达肝细胞和胆管细胞标志，可以分化为肝细胞或胆管细胞，因此被认为是肝干细胞的胚胎来源。Dan等［2］从74～108 d人胎肝中分离得到的人胎肝多潜能祖细胞，体外培养，具有强增殖力，并可分化为肝细胞、胆管上皮细胞、脂肪细胞等其他组织来源的细胞，在移植入肝病动物模型后可分化为有功能的肝细胞并长期存活。由于胎肝细胞易于大量分离培养，因此是很好的移植细胞供体，但由于来源涉及伦理问题限制了其临床应用。

　　1.2成体肝内干细胞对成体肝内干细胞的研究已取得较大进展，已成功分离、培养并移植。其中Farber在研究动物肝癌模型时发现的肝卵圆细胞是最早发现并被认可的一类肝干细胞，其形态特征是细胞小，仅6～8 μm，核大，呈卵圆形，核/质比例大，胞质内细胞器少，含少量线粒体和粗面内质网，核内有凝聚的染色质，可同时表达肝细胞和胆管细胞的表面标志如CK-7、CK-8、CK-18和CK-19等。Petersen等［3］发现A6阳性的肝卵圆细胞也表达Thy-1、sca-1、CD34和CD45等造血干细胞标志。2006年Davies等［4］利用永生化卵圆细胞系PIL-2研究发现环氧合酶COX-2SC-236可以诱导卵圆细胞数量减少。同年Suzuki等［5］研究发现IL-15可以明显上调卵圆细胞的累积，增加肝再生能力。最近Szabo等［6］在研究肝再生模型时发现肝卵圆细胞表达Matrilin-2， 认为是一种新的卵圆细胞标志。而 Jelnes等［7］在研究不同类型的肝再生模型时发现卵圆细胞具有明显的异质性。除卵圆细胞外在成体肝内还发现了其他的肝干细胞。Mitaka等［8］从成体大鼠肝内分离到与卵圆细胞类似的细胞，称为“小肝细胞”，大小是成熟肝细胞的1/3～1/2，呈单核、低分化形态，在培养中形成克隆并分化为有功能的成熟肝细胞。Fujikawa等［9］从成体小鼠肝内分离甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP ），AFP阳性细胞具有未分化内胚层细胞的特征，体外培养可以分化为肝细胞和胆管上皮细胞。Khuu等［10］在人原代肝细胞培养时发现肝上皮细胞表达肝细胞、胆管细胞和干细胞的标志，认为是另一种人肝干细胞。Cerec等［11］从人HepaRG细胞群中分离到了具有双向潜能的肝干细胞，体外培养可以分化为肝细胞样和胆管细胞样细胞，认为也是一种肝内干细胞。

　　1.3骨髓来源的干细胞很多学者认为造血干细胞可以作为肝干细胞的肝外来源。Avital等［12］研究证实从骨髓分离的造血干细胞移植入受体后，可整合到受体肝板，分化为成熟肝细胞并合成尿素。Harris等［13］以绿色荧光蛋白报告基因转染干细胞并进行性别交叉移植实验，发现分化的肝细胞没有表达荧光蛋白，且仍为双倍体，进一步证实了骨髓造血干细胞可横向分化为肝细胞。而Grompe［14］认为骨髓来源的肝细胞是通过细胞融合而不是分化为肝细胞。而Oh等［15］研究发现在一定生理条件下，一部分肝细胞可以来自骨髓，没有发生细胞融合。除骨髓造血干细胞外，骨髓间充质干细胞、基质干细胞也被认为是肝干细胞的来源。

　　1.4其他肝外干细胞目前从许多肝外组织中如胰腺、唾液腺、羊膜和真皮中均发现了可以分化为肝细胞的干细胞。另外胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）由于具有多潜能，且可以分化为各种细胞，所以也被认为是肝干细胞的来源之一。

　　2.1定位由于缺乏特异性标志物，卵圆细胞在肝脏中的定位较为困难。干细胞主要位于汇管区、纤维隔和终末胆管树即赫氏管周围。肝脏祖细胞位于门脉周围及整个肝小叶。Burke等［16］认为卵圆细胞存在于门周区和肝实质内。

　　2.2来源肝干细胞与胚胎时期的原始肝内胆管一样均表达肝细胞和胆管细胞的表面标志，因此原始肝内胆管细胞可能是成体肝卵圆细胞的祖细胞。Avital等［12］证实灵长类动物胎肝中存在具有双重表现型的原始肝脏上皮细胞，在体外表达白蛋白、AFP的肝细胞和表达CK-7、CK-19的胆管细胞，因此认为成体肝脏内干细胞是胚胎时期胎肝中的干细胞的遗留。也有许多学者认为骨髓是肝内干细胞的来源之一，并且在一定条件下如肝损伤时可向肝内运输补充干细胞池，参与肝损伤的修复［17］。

　　3.1肝干细胞的分离纯化培养因为干细胞数量较少，想分离肝干细胞，首先要使其大量增生，需要建立肝干细胞增殖模型。最早是1977年Solt D和Farber E建立的Solt-Farber模型。1983年Solt等［18］对此模型进行了改良，即目前最常用的肝卵圆增殖模型。另外用乙硫氨酸、N-乙酰对氨基酚、倒千里光碱、Dipin和D-半乳糖胺等均建立了肝卵圆细胞增殖模型。Ise 等［19］结扎大鼠的70%的门静脉也获得了肝干细胞增殖模型。 Gordon等［20］利用两步胶原酶法从大鼠分离得到小肝细胞。Nakauchi ［21］采用FACS法从13.5 d小鼠胎肝内分离得到表达C-MetCD49fc-kitcd45Ter119的肝干细胞。2005年Stamp等［22］使用免疫磁珠分离法和单克隆抗体GCTM-5从人胎肝中分离到人肝胚细胞和肝胆上皮细胞亚群。荧光活化细胞法和免疫磁珠法均需要特异性抗原和抗体，由于目前还未发现肝卵圆细胞的确切表面标志，此类方法仍需改进。肝干细胞的体外培养较困难，因为在体外干细胞很容易自身分化为肝细胞而失去增殖能力，目前的研究发现生长因子、细胞外基质和饲养层有利于干细胞的体外培养。Suzuki等［5］利用层黏连蛋白包被培养板并加入肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF，50 ng/mL）获得了干细胞体外培养细胞克隆。Monga等［23］在培养液中加入HGF、SCF、Flt-3后培养发现肝干细胞可大量增殖，而He等［24］在培养板中加入PREF即成纤维细胞饲养层，结果有饲养层的培养板中肝干细胞增殖明显并保持未分化状态3个月，而无饲养层的培养板中肝干细胞很快分化。

　　3.2肝干细胞移植肝干细胞移植借鉴了肝细胞移植的方法。Kusano等［25］认为在肝脏未发生较大结构破坏时是最佳移植部位，而当肝脏严重受损时不利于干细胞的成活，需要异位移植。而在所有肝外器官中脾脏是肝细胞的最佳部位。移植方式以经门静脉注入干细胞和脾内注射两种方法最为常用。Avital等［12］用骨髓干细胞悬液经近侧门静脉注入，发现干细胞在肝脏内增殖状况良好。Matsusaka等［26］采用夹闭脾门处静脉将干细胞悬液注入脾内，然后结扎门静脉左支的方法增加细胞在脾内着床的机会。Fang等［27］在将干细胞移植入肝硬化小鼠的肝脏内发现肝损伤程度减轻，并且移植的干细胞分化为肝细胞并表达白蛋白。Kashofer等［28］将纯化的造血干细胞移植入I型酪氨酸血症模型大鼠体内，重建了肝脏的生化功能，缓解了病情。最近，Yu等［29］报道将表达HGF的间充质干细胞植入大鼠肝移植模型后发现植入的干细胞与受体肝融合并分泌白蛋白，表明干细胞移植可以改善肝再生。

　　目前研究最多的是骨髓造血干细胞和外周血干细胞自体移植。2002年Kumar等［30］报道，对1例原发性淀粉样变患者肝移植术后淀粉样变复发实施自体骨髓干细胞移植，28个月后发现其症状体征明显改善。2006年Arai等［31］报道，对43例暴发性肝衰竭（fulminant hepatic failure，FHF）患者和45例急性自限性肝炎（acute self-limited hepatitis，AH）患者进行血OPN（osteopontin）检测比较，发现FHF平均血OPN水平高于AH患者（P=0.003），而且OPN高的患者预后较差。同年Tsamandas等［32］对77例丙型肝炎的肝活组织检查标本分析发现肝祖细胞（hepatic progenitor cell，HPC）的表达与疾病的严重程度呈正相关，并由此提出HPC的生长和增殖可以作为预后的一项重要指标。Katoonizadeh等［33］对74例急性亚急性重症肝损伤患者的肝活组织检查进行分析发现，组织中增生肝细胞和HPC的比例与临床肝损伤程度呈正相关，肝细胞损失和HPC活化较少，而成熟肝细胞大量增生的活组织检查标本的患者生存率较高。Gupta等［34］报道，对12例先天性肝硬变患儿行自体干细胞移植，5例因肝硬变进展死亡，7例存活，其中4例胆管炎消失，5例有黄便，3例肝硬变硬度减轻，6例肝功能改善，6例食欲提高，肝胆管扫描4例胆汁排泄改善，病理学组织检查示3例肝硬变改善，再次证实了干细胞移植治疗肝硬变的临床效果。

　　肝干细胞的研究已经在动物模型和临床研究中取得了部分成功，为最终治愈肝脏疾病开辟了新的研究方向。尽管还有很多问题尚未解决，如：肝干细胞确切的特异性标志，更成熟的干细胞分离、纯化、鉴定、体外培养技术，干细胞的确切增殖分化机制，如何防止其癌变等，但越来越多的成功报道已经向世人展示了其广阔而美好的应用前景，为临床治疗终末期肝病带来了新的曙光。

　　脂肪细胞起源于脂肪组织中存在的问充质干细胞，与骨髓基质中存在的干细胞一样，该细胞因具有自我更新、活力持久及多向分化潜能等干细胞特征而被称为脂肪源性干细胞(adipose-derivedstem cells，ADSCs)。Zuk等从脂肪组织中分离出了一种成纤维细胞样细胞，它与骨髓间充质干细胞形态相似，称之为脂肪干细胞(ADSCs)，平均每300ml脂肪组织可获得2×108～6×108个这样的细胞。ADSCs不像骨髓间充质干细胞对培养基中胎牛血清的来源有严格的要求，在加入任何批号胎牛血清的DMEM培养基中都能分化成脂肪细胞。此外，骨髓问充质干细胞也可分化为脂肪细胞。Mauney等将MSCs孵育在含有10％胎牛血清、lO％正常大鼠血清、10-％ol／L的地塞米松，5ug／ml胰岛素的a-MEM培养基中，2天后撤去地塞米松，继续9呼育5～7天后，MSCs分化成为脂肪细胞。

　　ADSCs和MSCs具有相同的表现型，对CD29、CD44、CD71、CD70、CD105／SH2和SH3为阳性反应，对CD31、CD34和CD45。为阴性反应。ADSCs有两个特征性表达分化抗原CD49d和CD。∞，前者肯定存在而后者肯定没有，与MSCs情况相反。

　　能向脂肪细胞分化的ADSCs在激素、生物活性因子、寒冷等因素刺激下均能逐渐分化为单能干细胞，即脂肪母细胞，它保持着干细胞增殖活跃的特性。脂肪母细胞再进一步分化为前脂肪细胞，也是通常人们所说的脂肪细胞前体。前脂肪细胞再经历细胞融合，接触抑制和克隆扩增等步骤启动向成熟脂肪细胞分化，并在胰岛素、地塞米松等诱导剂作用下完成向成熟脂肪细胞的分化。全过程可以表示为多能干细胞一脂肪母细胞一前脂肪细胞一不成熟脂肪细胞一成熟脂肪细胞。

　　生长期前脂肪细胞的形态与成纤维细胞相似，经诱导分化，其细胞骨架和细胞外基质发生变化，开始进入不成熟细胞向成熟细胞转变。细胞形态由成纤维细胞样逐渐趋于类圆或圆形，胞体逐渐增大，胞质中开始出现小脂滴，脂质开始累积。以后小脂滴增多并融合为较大的脂滴，可经油红“0”染色等方法于显微镜下显色，从而获得成熟脂肪细胞的形态特征。此时的细胞无增殖能力，为脂肪细胞分化的终末阶段。

　　3．1．1脂蛋白脂酶(LPL)：LPL是一个60kD的糖蛋白，在前脂肪细胞阶段即有表达，并随分化表达逐渐增加，到分化晚期趋于稳定。LPL在能量代谢和脂质积聚中发挥重要作用，但由于ADSCs在分化为前脂肪细胞时缺少LPL的表达，因此LPL已成为脂肪细胞分化的重要因子，是干细胞分化为前脂肪细胞的经典标志。

　　3．1．2前脂肪细胞因子(pref－1)：pref-l为跨膜蛋白，其胞外有6个连续的表皮生长因子样结构域。与LPL截然不同，pref-l是脂肪细胞分化早期具有抑制作用的因子。pref-1的持续高表达可明显抑制脂肪细胞的分化。有研究表明[6]pref一1可能抑制p42／p44MARK通路，阻断胰岛素样生长因子受体的信号传递，从而抑制脂肪细胞分化。

　　3．2晚期标志：脂肪细胞进入终末分化阶段，晚期标志开始出现。主要包括：①三酯代谢相关的酶类，如乙酰辅酶A脱羧酶，三磷酸脱氢酶，脂肪酸合成酶等；②激素相关蛋白，如胰岛素敏感性葡萄糖转运蛋白，胰岛素受体等；③成熟脂肪细胞特异产物，如脂肪细胞脂结合蛋白，脂肪酸转运蛋白，脂联素(acrp30)和抵抗素(resitin)。上述因子中，尤其以后两者备受关注。acrp30是30kD的分泌性蛋白，重组acrp30可显著降低肥胖动物体内的血糖和游离脂肪酸，增强脂肪氧化，减轻体重和胰岛素敏感性，由此提示acrp30可能是肥胖及胰岛素抵抗发生中的重要保护因子。抵抗素的N端为信号肽，它是晚期分化的特异信号分子，重组抵抗素能使正常小鼠出现胰岛素抵抗症状，而其抗血清却能够改善胰岛素抵抗症状，因此，有学者认为抵抗素是联系胰岛素抵抗与肥胖之间的纽带，此观点还需进一步考证。

　　脂肪细胞分化过程中有大量的基因表达。主要有C／EBPs家族，PPARs家族，还有螺旋一环一螺旋转录因子家族等其他转录因子。其中以前两者研究的最多。

　　4．1 C／EBPs家族：C／EBPs家族因其具有激活特定基因DNA增强子CAAT重复序列的功能也被称为CAAT／增强子家族。它包括C／EBP a、B、6三个成员，这三个成员分别在细胞分化过程中按一定时序规律地表达[9]。C／EBP B、6最先表达于前脂肪细胞，受诱导剂作用于分化早期短暂表达增高，并协同促进PPAR-Y和C／EBP Q的表达。c／EBP Q的表达则相对较晚，受C／EBP B、6和PPAR-Y的调节后，通过脂肪细胞特异基因的表达，促进脂肪细胞进入终末分化阶段。

　　4．2 PPARs家族：PPARs家族为II型核受体超家族，主要有a、B、Y、6四个亚型，与配体结合后与视黄酸类受体形成异二聚体，结合于靶基因启动子上游的过氧化物酶增殖体反应元件而发挥转录调控作用。其中，PPAR―Y的作用较为突出，PPAR-Y可通过调节转录因子CAAT／增强子结合蛋白a、脂代谢关键酶或转运蛋白、脂肪细胞分泌蛋白表达，影响脂肪细胞分化进程。因此，PPAR-Y被誉为脂肪细胞分化的内在调定点。

　　4．3螺旋一环一螺旋转录因子家族：螺旋一环一螺旋转录因子家族有两个成员，它们分别是脂肪细胞决定和分化依赖因子l(ADDl)和固醇调节元件结合蛋白1(SREBPl)。二者可独立作为转录因子调节脂肪细胞的分化和胆固醇的转录。

　　其他与脂肪形成有关的转录因子还包括孤束核受体ROR Y和ERR a、各种STAT蛋白，它们可能具有诱导和维持终末分化的功能，但对此功能尚未进行深入的研究。

　　人们发现，脂肪细胞的其他重要功能也被逐渐发掘出来。脂肪组织可以分泌多种生物活性物质一脂肪因子，这些因子作用于中枢神经系统、免疫系统及内分泌器官，如垂体、性腺、甲状腺和内分泌胰腺，参与神经、内分泌、免疫网络和组织损伤的修复。

　　5．1脂肪细胞的分泌功能：脂肪细胞具有多种内分泌、旁分泌及自分泌功能。现已发现人脂肪细胞能分泌100多种脂肪细胞因子(adipocytokines)，对全身各器官，也包括脂肪组织本身具有重要的调节功能。在这些脂肪因子中，研究比较多的有瘦素、抵抗素、肿瘤坏死因子(TNFa)、白细胞介素(IL)～lb、IL-6、IL-8、IL―10、IL-18、网膜素、纤溶酶原激活物抑制物一1、肝磷脂结合上皮生长因子样生长因子和血管紧张素等。其中脂联素是脂肪细胞表达最丰的激素，它通过内分泌、旁分泌及自分泌作用于肝脏、脑、骨骼肌、血管及脂肪组织自身，调节能量代谢、抗炎及抗动脉粥样硬化。抵抗素在2001年被发现，并以其诱导胰岛素抵抗的效应而被命名。1985年，TNF a被检出为炎性因子，1993年发现它也为脂肪因子。TNF a诱导胰岛素受体底物一l(IRS-1)丝氨酸的磷酸化，既诱导胰岛素抵抗，同时也诱导胰岛B细胞的凋亡。血液循环中的IL-6有25％由皮下脂肪组织分泌，其免疫调节功能甚为重要。2005年最新报道的网膜素有提高胰岛素处置葡萄糖的效应，而内脂素则独立于胰岛素而又有类似胰岛素的作用。

　　最近，Fukuhara等利用DD-PCR技术发现了又一新的脂肪因子，命名为内脏素，序列分析显示内脏素即为前B细胞克隆增强因子(PBEF)。人PBEF由473个氨基酸组成，分子量约52kD。该分子缺乏经典的分泌性蛋白信号肽序列。目前已知的PBEF功能有：①在B细胞发育的早期，PBEF可增强干细胞因子和IL-7的促前B细胞克隆形成，在B细胞的分化与成熟中发挥重要作用；②PBEF具有抗凋亡作用；③PBEF具有烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicot inamide phosphoribosy tran-ferase，NAmPRTase)的活性，参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的合成；④PBEF是与细胞周期相关的蛋白；⑤与分娩有关等。

　　上述这些因子分别和内分泌神经中枢、肾上腺、胰岛、骨骼肌、肝脏、心肌及血管内皮等细胞进行脂一脑、脂一胰、脂一肌及脂一肝等的对话，形成复杂反馈网络，以维持糖脂代谢，调节血管内皮功能以及机体的免疫功能等。

　　5．2脂肪细胞的创伤修复功能：瘦素通过刺激JNK信号转导途径促发转录蛋白活性，并将细胞外刺激信号转导入细胞核内，通过细胞外信号调节激酶磷酸化，使伤口边缘角质形成细胞的增殖能力明显增强。除了瘦素外，脂肪细胞分泌的TNF-a、IL-6及IL-8等也参与创伤修复中的炎症介导反应。纤溶酶原激活物抑制物－1、血管紧张素原、性激素类(特别是雌激素)、视黄醇结合蛋白质、脂蛋白脂酶、抵抗素和游离脂肪酸等都与创伤修复有关。

　　5．3脂肪细胞的免疫功能：瘦素可以刺激人外周T淋巴细胞活化和增殖，促使细胞表面活化标记膜分子在T淋巴细胞上表达，受刺激后的T淋巴细胞产生更多的Thl细胞因子如IL-22、干扰素一Y，使T细胞向Thl细胞分化。瘦素还可体外诱导单核细胞表达促炎细胞因子IL26和TNF-a，从而活化淋巴细胞，诱导巨噬细胞表达粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、G-CSF，刺激粒细胞的功能。

　　瘦素和脂联素还可刺激脂肪组织本身分泌IL-1 B、IL-6、TNF-a和前列腺素－2释放，该作用可被抗炎因子RKl／2促原活化蛋白激酶抑制因子U0126、PPAR―y配体曲格列酮和NF―KBBAY 11-7082抑制鉴于瘦素的免疫功能，有人提出将瘦素作为免疫治疗的新靶点。

　　关节软骨处在一个具有压应力、张应力、流体剪切力等机械应力作用的复杂力学环境中，而机械应力在调节关节软骨细胞生物学行为中具有十分重要的作用，能够对软骨细胞新陈代谢进行调控，是保证软骨基质正常状态的必要条件。可调控软骨细胞的新陈代谢，是维持正常软骨基质必不可少的条件。关节软骨组织缺乏血液供应、细胞代谢缓慢、自我修复能力较差，即使较小的软骨损伤也会引起严重的后果。我们的前期动物实验表明，中等强度的炮台运动能促进大鼠软骨缺损的修复重塑，但其作用机制尚不清楚。

　　本研究拟通过体外实验对大鼠关节软骨加载周期性压应力，观察应力下的软骨细胞形态和细胞骨架的变化，为软骨细胞内力一生物信号转化研究提供基础，为适度应力促进关节软骨缺损修复重塑的机制研究提供依据。

　　主要包括大鼠来源及所用试剂的来源。本研究中所用大鼠为7d龄，且身体健康，均由南方医科大学实验动物中心提供。主要试剂：鼠抗人Tubulin B单克隆抗体（北京中杉金桥生物进口分装）；Dulbecco改良DMEM/Ham F12混合培养基（HyClone公司）；0.01mol/L磷酸缓冲液PBS（博士德公司）；碘化丙啶（Salarbio公司）；链菌蛋白酶（Gibco公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；番红（Salarbio公司）；胰蛋白酶（Gibco公司）；双乙酸荧光素（Salarbio公司）；甲苯胺蓝（Salarbio公司）；4%多聚甲醛（Salarbio公司）；II型胶原酶（Gibco公司）；山羊抗小鼠IgG/FITC思牵ū本猩冀鹎派物进口分装）；I型胶原蛋白裱衬的6孔培养板（Flexercell公司）。

　　主要包括四点弯曲加力装置（四川大学华西口腔医学院研制）；流式细胞仪（Coulter，美国）；CO2培养箱（ShelLab，美国）；倒置荧光显微镜（Olympus，日本）；数码相机（Olympus，日本）。

　　1.3.1软骨细胞的分离培养及应力加载 体外分离大鼠四肢的关节软骨并进行传代培养，细胞培养传至第3代，随机分为对照组（A组）和周期性机械应力组（B组）。A组：在正常条件下培养软骨细胞；B组：软骨细胞置于周期性机械应力体系中（4000u strain）培养30min，连续3d。加载应力组细胞卸载后与对照组细胞同时进行以下检测。

　　1.3.2番红及甲苯胺蓝染色 软骨细胞生长于柔性的硅胶膜上，选择PBS进行冲洗，并加入0.25%番红以及1%甲苯胺蓝染液，在室温条件下，进行孵育2h。随后利用显微镜进行观察拍照。番红染色可以明确氨基葡聚糖合成情况；甲苯胺蓝染色可以明确蛋白多糖合成情况。

　　1.3.3免疫荧光检测 当细胞的80%贴合于盖玻片后，在超净的工作台上放置一24孔的培养板，并取出贴有细胞的盖玻片，使用PBS液进行2次清洗，后加入2%的甲醛溶液，进行固定。固定后，使用0.5%的Triton液清洗细胞3次，每次10min。加一抗（sigma公司），在37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板上，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。后加如异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）标记的二抗（sigma公司），37℃条件下，静置1h。将盖玻片置于24孔板，0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min。将所有盖玻片放置于24孔板中，使用0.5%Triton液进行3次清洗，每次10min，后将清洗液弃去，加入4’，6-二脒基2-苯基吲哚（4’，6diamidino2-phenylindole，DAPI）进行染核，在室温条件下，进行5min。后在长方形的载玻片上低落封片剂，盖上盖玻片，并在室温条件下5min封片。用LCSM（LeicaSPS Germany）观察并记录图像。

　　1.3.5Western印迹检测cofilin蛋白表达 选择实验组与对照组中贴壁生长的软骨细胞悬浮液，并进行蛋白样品提取，以pierce公司生产的BCA蛋白定量检测试剂盒说明为标准稀释样品，进行蛋白浓度的检测，并选择5mg/mL的BSA液体将蛋白质标准品完全溶解，置于-20℃的环境下保存。选择取标准品用PBS 10mL，并将其稀释为100uL，保证液体的最终浓度为0.5mol/mL。进行SDS-PAGE电泳，再完成转膜的过程中加入一抗与二抗，并进行ECL发光。通过扫描仪进行扫描，将图像输入到Image J软件中进行图像的定量分析。

　　体外分离的大鼠关节软骨细胞培养24h后开始贴壁，72h后能够完全贴壁。并且大部分细胞表现为多边形，而细胞核表现为椭圆形或者圆形，能够清晰的观察到1～2个核仁。进行甲苯胺蓝染色后，形态学观察可见：大部分聚集于细胞内的呈深蓝色的蛋白多糖。而细胞核则被染色为深蓝色或者蓝紫色。进行番红染色后，形态学观察可见：大部分呈深红色的氨基葡聚糖阳性物质聚集于细胞内。加载组和对照组无显著差别，而应力组的关节软骨细胞发生形态改变，并且其取向逐渐趋于相同。见图1A～D。

　　实验组软骨细胞微丝为与细胞长轴平行的线状均匀纤维，排列整齐，呈线状拉伸，核深染。对照组软骨细胞微丝形态及分布较散乱，纤维显稀疏，与对照组比较核淡然。见图2A～B。

　　实验组软骨细胞边缘平整、锐利，细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。对照组软骨细胞微管荧光强度明显较弱，边缘模糊，未见明显核周聚集区。见图2C～D。

　　实验组软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带，中间纤维扩展的细胞外基质的部分呈现为亮带外周的微弱绿色荧光。对照组软骨细胞中间纤维排列紊乱，荧光强度普遍较弱，呈波浪状围绕细胞核分布，个别细胞中存在中间纤维的斑块状聚集，膜周亮带较弱或无，亮带以外微弱绿色荧光较宽。见图2E～F。

　　RT-PCR检测显示实验组软骨细胞cofilin基因表达为（1 52±0.12），对照组为（0.99±0.01），两组相比差异具有统计学意义（t=31.123，P=0.000）。见图3。

　　实验组软骨细胞中cofilin蛋白表达明显高于对照组软骨细胞cofilin蛋白的表达。见图4。

　　软骨在动物全身关节活动中发挥着重要作用，其含有特殊的软骨基质，因而能够承受一定的机械力而不会发生永久变形。同样，在软骨的生长发育过程中，其形态和功能的维持及损伤后的修复也离不开力学刺激，缺乏力学刺激会导致软骨退行性变。

　　软骨细胞在机械力的传导和转化方面起着举足轻重的作用。细胞形态是细胞功能的体现形式，是细增殖分化与凋亡等诸多胞内事件的参与者，同时，细胞形态与细胞所处的力学环境密不可分，是细胞内部力平衡的最直观外在表现，因此，对软骨细胞的形态研究，是研究机械应力影响软骨修复机制的基础。

　　本实验中在周期性机械应力刺激下，大鼠关节软骨细胞附壁生长良好，能够合成有软骨细胞生物学特点的粘多糖和氨基葡聚糖，并促进软骨细胞的规则排列，说明在软骨细胞的生长过程中，周期性的机械应力具有较为积极的刺激作用。临床研究证实，外力施加载荷的频率、时间与大小等均是影响软骨细胞新陈代谢和生长的刺激因素。本实验中的细胞特殊染色技术只能定性分析粘多糖及氨基葡聚糖的含量，而无法从蛋白表达的基因水平辨别蛋白合成过程中的微小差别。仍然需要更加深刻的定量分析研究，对基因和蛋白层面进行探讨，进一步阐述周期性机械应力对软骨细胞的刺激作用。

　　细胞骨架是维持细胞形态的重要部分，同时在维系软骨细胞功能方面也具有十分显著的作用。细胞骨架包括微丝、中间z与微管是胞骨架的组成部分，联合各种具有不同作用的调控蛋白共同构成细胞内部蛋白纤维网络体系。细胞骨架明显的为力学信号发生转导提供了十分理想化和有效化的途径。在细胞受到外界力学的刺激后，会导致细胞骨架发生重新排列，导致使细胞内应力随之发生相应的重新分布。细胞骨架的改变不仅会造成细胞形态的变化，同时也会导致细胞力学特征及生物学特征发生变化。

　　微丝是真核细胞中含量最丰富的一种蛋白复合体，是细胞骨架的主要成分之一，是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的纤丝，又称肌动蛋白丝，F-actin是细胞骨架微丝蛋白的主要成分，与细胞黏附、吞噬、运动、等密切相关。细胞伸出的丝状伪足参与细胞间的通讯并使细胞具有趋化性，产生细胞形态的变化，而成束的微丝对丝状伪足起支持作用。压应力作用于软骨细胞后，微丝会出现不同方向的变化，增加细胞顶-底纵向的微丝张力，但横向微丝张力未发生变化。外界刺激到达阈值后，会破坏Actin微丝和Vimentin中间纤维聚集以及解聚的动态平衡，导致微丝发生生物学降解。应力信号通过细胞骨架网络结构传递至细胞内激活相应的信号转导通路，反馈调控，使其与组蛋白、DNA相互作用来调节复制和转录过程，细胞骨架发生重组，使细胞维持一定的机械强度适应机械力。

　　本研究中免疫荧光染色显示应力组较对照组微丝致密且分布均匀，荧光强度增强，取向趋于一致。实验组细胞微管呈网络状分布于各个细胞内以维持细胞形态，在核周可见明显的斑点状微管聚集区。而加载周期性机械应力后的软骨细胞中间纤维围绕细胞核且从细胞核到细胞膜呈递增的贯穿分布，呈平滑的细丝状，成束成网，在细胞膜周围分布密集，形成亮带。这些现象均表明周期性应力可促进软骨细胞的骨架重排，提高其力学适应性，而细胞骨架在软骨细胞的力学一生物学信号转导中发挥着重要作用。

　　树突状细胞（Dendritic cells，DC）是机体内重要的抗原提呈细胞，可激发 B 和 T 淋巴细胞介导的免疫反应[1]。细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine- induced killer cell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子及抗体共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性[2]。DC能识别处理肿瘤细胞，并把肿瘤细胞的相关信号传递给CIK细胞，使之发挥杀伤肿瘤细胞的功能。因此，DC能显著提高CIK细胞针对肿瘤细胞的杀伤活性[3]。[A1]本次实验的起止时间为2012年10月―2013年7月，实验从正常人外周血中分离DC和CIK，来诱导培养DC、CIK 产生DC-CIK细胞，然后通过对比DC-CIK细胞和化疗药物顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效果，来探索一种更为有效的免疫治疗方法，为临床研究提供理论依据。

　　1.2.1 CIK细胞的诱导和扩增 取健康成年人外周全血30 mL，用等量Ficol1分离出PBMC。调细胞浓度为1×106/mL，置于37℃、5%CO2培养箱培养2h。收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为1×106/ml，并加人1000 U/mL的IFN-γ悬浮培养，24h后加入50ng/mL的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，每隔3 d半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为1×106/mL。在培养的第7 d，收获CIK细胞。然后加入新鲜DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

　　1.2.2 DC的体外培养 在PBMC培养2 h之后的贴壁细胞中，加入含1000 U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4的GT-T551无血清培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。每3 d换液1次并补充细胞因子，诱导单核细胞向DC细胞分化，在培养的第7 d，加入500U/mL重组人TNF-a，诱导DC细胞成熟；共培养到第9 d。收获DC细胞。

　　1.2.3 DC与CIK细胞共培养 将DE与CIK细胞混合，比例为DC：CIK=1：5，培养液为CIK培养液。无血清培养液中添加重组人IL-2 （300 U/mL）。

　　1.2.4 细胞传代培养 采用冻融法。消化收集对数生长期的MCF-7细胞，用PBS液离心洗涤2遍，再用PBS液重悬为1×107/mL，封装入冻存管。

　　1.2.5 DC-CIK作用于MCF-7 将MCF-7细胞稀释为5×105个细胞/mL的浓度，每孔100 μL加入96孔板培养24 h。将培养好的DC-CIK细胞，稀释为5×106 /mL及10×106 /mL的浓度，每孔100 μL加入到已经培养24 hMCF-7细胞的96孔板中，置于37℃ CO2培养箱共同培养。每个组共设5个重复孔。在共培养时间上分为12、24和48h3个组别。每个96孔板上均设置空白对照组，对照组不干预。

　　1.2.7 MTT检测MCF-7的增殖 在转染12、24、48 h后采用MTT法检测MCF-7细胞的凋亡情况。将各组细胞制成浓度为2000 个/ml 的细胞悬液，然后将200 μL/孔的细胞悬液接种到96 孔板中继续培养，在12 h后每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），再在37℃条件下培养4 h；弃去上清液，每孔加入DMSO为150μl，37℃条件下振荡15 min，使用酶标仪490 nm波长测定A 值。并记算各组的杀伤率。杀伤率=[1-（实验孔A值-效应细胞对照孔A值）/靶细胞对照孔A值]×100%。

　　采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量数据以（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P

　　在显微镜下观察MCF-7细胞增殖情况。在加入DC-CIK后，MCF-7细胞出现了部分凋亡现象，对照组MCF-7细胞呈现正常生长状态。

　　化疗药物顺铂作用与MCF-7细胞后显示出对增殖的明显抑制作用，而且随着作用时间及顺铂浓度的增加，抑制的效果也越明显。L值均

　　将DC-CIK 和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的进行比较，结果显示，5×106个细胞对MCF-7细胞增殖12 h的抑制作用与40 ng/ml浓度的顺铂对MCF-7细胞增殖12 h的抑制作用相等同，而作用24 h的抑制作用与50 ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24 h的抑制作用相等同，作用48 h的的抑制作用与60 ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24 h的抑制作用基本相等同。

　　DC-CIK 细胞具有很多优点，对原发性、转移性肿瘤均有良好的疗效，并且对多重耐药、放化疗无效的肿瘤细胞也有效；可以明显的预防肿瘤的复发；能够显著地提高机体免疫力，激发全身性的抗癌效应[4-5]。目前DC-CIK细胞对乳腺癌细胞作用的研究还处在起步阶段，刘苗等[6]研究发现，DC-CIK细胞在体外可以大量增殖，溶瘤作用强。另有研究表明，CIK细胞的溶瘤率为15%，而DC-CIK细胞溶瘤率可以达到71%，且能诱导机体分泌高水平的IFN-γ，可调节和增强机体的免疫功能，提高间接杀瘤作用[7-8]。该研究着眼于实验室基础性研究，通过DC-CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞增殖的体外作用实验，发现DC-CIK细胞对MCF-7细胞增值存在很好的抑制作用，杀伤癌细胞作用与作用时间及效靶比均呈正相关；在某一浓度与作用时间上，DC-CIK细胞与顺铂对MCF-7细胞的抑制有相同作用，DC-CIK细胞对MCF-7细胞具有与顺铂类似的增殖抑制作用，并且，该研究结果提示DC-CIK法可以取得化疗药物相同的对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，且无化疗药物的副作用，为进一步临床实验打下了坚实的基础，在临床治疗乳腺癌方面具有很高的应用价值。

　　目前，DC- CIK 细胞在肿瘤的临床治疗已经开展，但开展时间较短，数据也不丰富，需继续扩大 DC -CIK 细胞治疗的临床应用范围，以获取更多的临床资料。另外，DC- CIK 细胞与天然药物、药物，甚至疫苗结合杀伤肿瘤细胞也是一个很好的研究方向。曲佳等[9]将冬凌草甲素与DC- CIK 细胞结合杀伤人多发性骨髓瘤RPMI 8266细胞，发现冬凌草甲素能明显提高DC- CIK 细胞的杀瘤活性。李雄兵等[10]将卡介苗与DC- CIK 细胞联合应用于裸鼠结肠癌肝转移的抑制作用，取得了良好的效果，也为DC- CIK 细胞的临床应用提供了宝贵的经验。

　　综上所述，随着医学生物科技的迅猛发展，细胞免疫治疗逐渐成为一种崭新的治疗模式，尤其是DC-CIK 细胞，目前已经小规模应用于临床治疗恶性肿瘤，并取得了很好的治疗效果。在目前的癌症多学科综合治疗理念下，为使乳腺癌患者获得最佳的治疗效果，在接受手术、放化疗等标准治疗后，细胞免疫治疗不失为一种比较可取的辅助治疗手段，而DC-CIK 细胞将成为首选方案。该疗法可单独用于治疗，也适宜作为手术或放化疗后的辅助疗法，以提高疗效和改善生存质量。因此，该法已成为肿瘤治疗的手段之一，为预防肿瘤复发、消除患者体内残留的肿瘤细胞、改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的治疗途径。

　　[1] 尤渺宁，任军，邱立军，等.树突状细胞体腔回输治疗恶性体腔积液的疗效观察及护理[J].进修杂志， 2013， 28（1）： 87- 88.

　　[2] 于卉影，孙英慧，蔺迪，等.肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3+CD56+细胞的体外扩增能力[J].细胞与分子免疫学杂志， 2014， 30（7）：748-753.

　　[3] 王睿斌， 郝筱诗，齐保聚，等.晚期直肠癌患者DC-CIK 免疫干预前后D二聚体改变的临床研究[J].2014， 18（2）： 247- 250.

　　[4] 匡幼林，邓远忠，梁思敏，等树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞抗前列腺癌细胞的免疫效应[J].重庆医学， 2014，43，（17）： 2167- 2169.

　　[6] 刘苗， 金润铭， 姜毅. 树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞生物学特性和体外杀瘤机制[J]. 实用儿科临床杂志， 2011， 26（1）： 35- 38.